1. De cellen die moeten worden gecryopreserveerd, moeten in een staat van goede groei (log-fase) en een hoog overlevingspercentage verkeren, met een dichtheid van ongeveer 80-90%.
2. Controleer voor het invriezen of de cellen hun unieke eigenschappen nog behouden.
Hybridoma moet bijvoorbeeld één tot twee dagen vóór cryopreservatie worden getest op antilichaamproductie.
3. Besteed aandacht aan de kwaliteit van cryoprotectant.
DMSO moet van reagenskwaliteit, steriel en kleurloos zijn (gefilterd met 0,22 micron FGLP Telflon of direct gekochte steriele producten, zoals Sigma D-2650), verdeeld in kleine volumes van 5-10 ml, bewaard bij 4 oC in het donker. Niet meerdere keren ontdooien. Glycerol moet ook van reagenskwaliteit zijn en na het autoclaveren in het donker worden bewaard. Na opening binnen een jaar gebruiken, omdat het giftig is voor cellen na langdurige bewaring.
4. Celconcentratie voor cryopreservatie:
(1) Normale menselijke fibroblast: 1~3 x 106 cellen/ml
(2) Hybridoma: 1~3 x 106 cellen/ml, de celconcentratie mag niet te hoog zijn, sommige hybridoma's zullen na 24 uur ontdooien sterven vanwege de hoge vriesconcentratie.
(3) Adherente tumorlijnen: 5~7 x 106, afhankelijk van het type cel. Adenocarcinoom vereist een hogere concentratie na ontdooien, terwijl HeLa slechts 1-3 x 106 cellen/ml nodig heeft.
(4) andere suspensies: 5~10 x 106 cellen/ml, menselijke lymfocyten moeten minimaal 5 x 106 cellen/ml zijn.
5. De concentratie van het cryoprotectant is 5 of 10% DMSO. Als de bevriezingsomstandigheden van de cellen onzeker zijn, moet een back-upcultuur worden gebruikt tijdens cryopreservatie om bevriezingsfalen te voorkomen.
6. Bevriezingsmethode:
(1) Traditionele methode: 4 oC 10 minuten ---> -20 oC 30 minuten ---> -80 oC 16-18 uur (of 's nachts) ---> Langdurige opslag in de dampfase van tank met vloeibare stikstof .
(2) Programmakoeling: gebruik een koelmachine met constant toerental om van kamertemperatuur tot –120 oC te verlagen met een snelheid van –1 ~ -3 oC/min, en bewaar deze gedurende lange tijd in de dampfase van een tank met vloeibare stikstof. termijn opslag. Het is geschikt voor de conservering van suspensiecellen en hybridoma.
7. Materiaal:
(1) Gekweekte cellen die goed groeien
(2) Vers medium
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Steriele plastic cryopreservatiebuis (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4% w/v trypaanblauw (GibcoBRL 15250-061)
(6) Hemocytometerplaat en afdekglas
(7) Koelmachine met constante snelheid (KRYO 10-serie II)
8. Stappen:
(1) Verander een dag voor het invriezen de halve of volledige hoeveelheid medium en observeer de celgroei.
(2) Bereiding van cryopreservatieoplossing (voorbereiding voor gebruik): Voeg DMSO toe aan vers medium, de eindconcentratie is 5-10%, meng goed en zet het op kamertemperatuur voor later gebruik.
(3) Volgens de werking van celsubcultuur, verzamel de gekweekte cellen en neem een kleine hoeveelheid celsuspensie (ongeveer 0,1 ml) om de celconcentratie en overlevingspercentage te tellen voordat ze worden ingevroren.
(4) Centrifugeer, verwijder het supernatant, voeg een geschikte hoeveelheid cryopreservatie-oplossing toe om de celconcentratie 1-5 x 106 cellen/ml te maken, meng goed en verdeel in de gelabelde cryopreservatiebuis, 1 ml/flacon, en neem een kleine hoeveelheid celsuspensie voor detectie van contaminatie.
(5) Cryopreservatiemethode 1: De cryobuis wordt gedurende 10 minuten bij 4 oC → -20 oC gedurende 30 minuten → -80 oC gedurende 16 tot 18 uur (of 's nachts) geplaatst → dampfase van de tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
(6) Vriesopslagmethode 2: De vriesbuis wordt in een koelmachine met constante snelheid met een vast programma geplaatst en vervolgens in een tank met vloeibare stikstof geplaatst.33
英语
阿拉伯语
���ļ���